Hybridizácia in situ

in situ hybridizácia je metóda detekcie chromozomálnych aberácií. Niektoré chromozómy sú označené fluorescenčnými farbivami a naviazané na DNA sondu. Táto technika sa používa na prenatálnu diagnostiku génových mutácií.

Čo je hybridizácia in situ?

V prípade hybridizácie in situ alebo Fluorescenčná in situ hybridizácia Nukleové kyseliny z RNA alebo DNA sa detegujú v určitých tkanivách alebo bunkách pomocou molekulárnych genetických metód. Tento typ diagnózy sa zvyčajne používa na zisťovanie štrukturálnej alebo numerickej chromozomálnej abnormality počas tehotenstva.

Na tento účel sa používa umelo vyrobená sonda, ktorá samotná pozostáva z nukleovej kyseliny. Potom sa viaže na nukleové kyseliny v organizme prostredníctvom párovania báz. Táto väzba sa myslí pod pojmom hybridizácia. Dôkazy sú založené na životnej štruktúre pacienta, a preto zodpovedajú dôkazom na mieste. Odlišuje sa to od metód in vitro, pri ktorých sa detekcia uskutočňuje v skúmavke. Túto metódu vyvinuli vedci Joe Gall a Mary Lou Pardue v 20. storočí.

Odvtedy sa technológia vyvíja. Zatiaľ čo v tom čase boli použité rádioaktívne sondy, dnes sa dnes používajú napríklad fluorescenčné sondy s kovalentnou väzbou na markerové molekuly.

Funkcia, účinok a ciele

Hybridizácia in situ sa zvyčajne používa na detekciu chromozomálnych aberácií, t. J. Chromozomálnych anomálií, ktoré sa nedajú zistiť v karyograme. To znamená, že metóda sa používa vždy, keď sa majú dedičné choroby určiť počas tehotenstva.

Pretože chromozómové aberácie sú problémom, ktorý by sa dnes nemal podceňovať, použitie tejto metódy sa časom zvyšuje. Hybridizácia sa uskutočňuje pomocou natívnych buniek z plodovej vody matky. Základom tejto techniky je väzba farebne označenej sondy na časti DNA. Vďaka väzbe je možné počet kópií neskôr vyhodnotiť pomocou mikroskopu, pretože jednotlivé kópie vysielajú svetelný signál a môžu sa teda zviditeľniť pod mikroskopom. Existujú rôzne postupy. Analýza sa uskutoční okamžite po väzbe.

V tomto prípade sa použije fluorescenčné farbivo, napríklad biotín, ktorý je naviazaný priamo na DNA sondu. V prípade nepriamej metódy hybridizácie in situ sa hodnotenie nemôže uskutočniť okamžite po hybridizácii, pretože fluorescenčné látky sa môžu k sonde viazať až po hybridizácii. Táto nepriama metóda sa používa častejšie ako priama metóda, pretože sa považuje za citlivejšiu. Okrem chromozómovo špecifických centrometrových DNA sond existujú aj lokusovo špecifické DNA sondy, chromozómovo špecifické DNA knižnice a porovnávacie hybridizácie genómov.

Chromozómovo špecifické centrometerové DNA sondy sa môžu použiť na detekciu chromozomálnych numerických anomálií. To znamená, že sa používajú hlavne v prípade podozrenia na duplikované alebo odstránené chromozómy. Lokálne špecifické DNA sondy sú zvlášť vhodné na detekciu minimálnych mutácií, ktoré sa nedajú detegovať v karyograme. Chromozómovo špecifická sonda DNA knižnice sa používa najmä na detekciu inzercií a translokácií.

Komparatívna hybridizácia genómu je na druhej strane komplexnou analýzou strát a ziskov v chromozomálnom materiáli. V súčasnosti je hybridizácia in situ veľmi dôležitá pri diagnostike rôznych chromozómových mutácií.Napríklad pri diagnostike Downovho syndrómu sa sondy viažu na chromozóm 21. Na tento účel sa zvyčajne používajú sondy špecifické pre chromozómy, ktoré sa môžu použiť v prípade podozrenia na túto chorobu.

Podozrenie môže vzniknúť napríklad vtedy, ak rodičia predtým porodili dieťa s týmto ochorením a obraz ultrazvuku je abnormálny. Ak namiesto dvojitej väzby existuje trojitý väzobný signál, a tak sa na výstup privádza trojitý farebný signál, diagnóza sa považuje za potvrdenú.

Riziká, vedľajšie účinky a nebezpečenstvá

Na rozdiel od PCR je napríklad hybridizácia in situ podstatne menej náchylná na kontamináciu. Okrem toho je čas potrebný na tento proces podstatne kratší. Pretože však predovšetkým embryá vytvárajú chromozómové vzorce, nemožno z daného modelu odvodiť zvyšok chromozomálnej distribúcie a teda genetický stav ostatných buniek.

Farebné signály sa môžu tiež prekrývať alebo zostať neviditeľné z iných dôvodov. Výsledkom je, že in situ hybridizácia ako diagnostický nástroj počas tehotenstva je pomerne náchylný k chybám. Môžu vzniknúť nesprávne diagnózy a rodičia sa môžu rozhodnúť proti zdravému embryu. S cieľom znížiť náchylnosť na chyby hybridizácie in situ by sa mali súčasne vyšetriť najmenej dve embryonálne bunky. Pri súčasnom preskúmaní dvoch buniek je teraz len zanedbateľné riziko nesprávnej diagnózy.

V takom prípade sa rodičia môžu úplne spoľahnúť na diagnózu. Hybridizácia na mieste sa neponúka každej tehotnej žene, ale iba ženám z rizikovej skupiny. Napriek tomu sa tehotným ženám na vlastnú žiadosť neodmieta tento druh diagnózy. Abnormálne nálezy ultrazvuku alebo abnormálne sérum môžu prinútiť lekára ponúknuť diagnostický postup. Aj keď veľká časť, ale v žiadnom prípade nie všetky, chromozomálnych aberácií môže byť diagnostikovaná pomocou in situ hybridizácie.

Hybridizácia in situ sa preto nesmie nikdy vykonávať samostatne, ale vždy sa musí používať v spojení s konvenčným chromozómovým testom. Pri tomto postupe zohráva hlavnú úlohu starostlivosť o tehotnú ženu. Pred analýzou má teda matka dôkladnú diskusiu o diagnostickej metóde, ktorá vysvetľuje riziká, možnosti a limity technológie.